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GBT18204.10-2000 游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定.pdf
1范围
本标准规定了游泳池水大肠菌群的测定方法。
本标准适用于游泳池水大肠茵群的测定。
2引用标准
下列标准所包含的条文,通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时,所示版本均为有效。所有标准都会被修订,使用本标准的各方应探讨使用下列标准***新版本的可能性。
GB/T 18204. 2- 2000 公共 场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定
3定义
本标准采用下列定义。
大肠菌群coliform bacteria
指一群在36'C士1C培养24 h能发酵乳糖、产酸、产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
第一法多管发酵 法.
4仪器
见GB/T 18204. 2--2000中第3章。
5培养基和试剂
5.1乳糖蛋白胨培养液
5.1.1 成分:蛋白胨 10 g
牛肉膏 3g
乳糖 5g
氯化钠 5g
1.6%(V/V)溴甲酚紫乙醇溶液 1 mL
蒸馏水 1000 mL
5.1.2 配法:将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1 000 mL蒸馏水中加热溶解,调pH到7.2~7.4。
5.1.2 配法:将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1 000 mL蒸馏水中加热溶解,调pH到7.2~7.4。
再加入1 mL1. 6%溴甲酚指示剂,充分混匀,分装到含有倒管的试管中,115C高压灭菌15 min.
5.2 伊红美兰琼脂
见GB/T18204.3~-2000中第4章第2节。
5.3 革兰氏染色液
见GB/T 18204.3- 2000中第4章第4节。
5.4染色法
见GB/T 18204.3- -2000 中第4章第5节。
6推测性试验
6.1在2个装有50mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100mL.
6.2在10支装有5mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10mL。
6.3轻摇试管,使液体充分混匀,置 36"C士1C培养箱中,培养24 h。
6.4观察每管是***产气,如不产气则报告为大肠茵群阴性;若有气体产生则为推测性试验阳性,需做进--步的证实试验。
7证实试验
7.1平板分离
自推测性检验阳性管中取一接种环培养液,接种到伊红美蓝琼脂平板上,置36'C土1C培养箱培养18~24h,观察菌落形态,典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色,具有金属光泽。
7.2复发酵试验挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,于36"C士+1C培养箱中，培养24 h.
7.3凡乳糖 发酵管***终产酸、产气,革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,为大肠菌群阳性。记下证实试验的阳性管数,查总大肠菌群(MPN)检索表得出1000mL水样中总大肠菌群的MPN值。
表1总大肠菌群(MPN)检索表
第二法滤膜法
8仪器
8.1 滤器。
8.2 滤膜;孔径0.45 um。直径根据滤器规格,目前常用的有35 mm和47 mm两种。
8.3抽滤设 备。
8.4无齿镊子。
8.5 其他仪器见GB/T 18204.2--2000中第3章。
9培养基
9.1品红亚硫酸钠培养基
9.1.1 成分:
蛋白胨 10g
酵母浸膏 5g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
琼脂 10-20g
磷酸氢二钾 3.5g
无水亚硫酸钠 5g
5%碱性品红乙醇溶液20 mL
蒸馏水 1000ml
9.1.2储备培养基的制备
将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900 mL蒸馏水的烧杯中,溶解后调pH值到
7. 2~7.4,加人琼脂加热溶解,用蒸馏水补足至1 000 mL,趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加人乳糖,混匀
9.1.3平皿培养基的制备
9.1.3平皿培养基的制备
将上述培养基加热融化,根据培养基的用量,碱性品红乙醇溶液与培养基按1↑50的比例,用灭菌另一个灭荫空试管内.加灭菌水少许使其溶解,在沸水浴中煮沸灭菌10 min。另一个灭荫空试管内.加用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液,滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪成淡粉红色为止。将灭菌水少许使其溶解,在沸水浴中煮沸灭菌10 min。
此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中,并充分混匀(防止产生气泡),立即将此种培养基适量倾人灭菌的空平皿内,待其冷却凝固后置冰箱内备用。此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色,则不能再用。
9.2乳糖蛋白胨培养液
10 操作步骤
10.1滤膜灭 菌:将滤膜放人含蒸馏水的烧杯中,煮沸灭菌三次,每次15 min。前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次,以除去残留溶剂。
10.2 滤器灭菌:用121C商压灭菌20 min或用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
10.3 水样过滤:用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将粗糙面向上,贴放在滤床上。固定好滤器,将X10' Pa(-0.5大气压)下抽滤。X10' Pa(-0.5大气压)下抽滤。
10.4 培养:水样滤完后,再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器。用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在乳糖琼脂分离培养基上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者之间不得留有气泡。然后将平皿倒置,放人36C士1C恒温箱内培养18~24 h.
10.5挑取滤膜上符合下列特征的茵落进行革兰氏染色、镜检。
紫红色,具有金属光泽的菌落;
深红色,不带或略带金属光泽的菌落;
淡红色,中心色较深的菌落。
10.6 将革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液中.于36C士1C培养48h.产酸产气者证实为大肠菌群阳性。
11 检验结果报告
计算滤膜上生长的证实为大肠菌样的菌落数,再乘以10即为每1000mL水样中的大肠菌群数。
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